這篇文竟是關于拉曼自動化反饋控制多種補料成分以實現(xiàn)高接種密度增強型fed-batch平臺過程的研究論文。該研究旨在開發(fā)控制策略，通過在線拉曼光譜法監(jiān)測和調(diào)整代謝物濃度，以實現(xiàn)高接種密度下的細胞培養(yǎng)過程中的高產(chǎn)量和穩(wěn)定性。具體使用了增強型high inoculation density (HID)高接種密度培養(yǎng)fed-batch平臺過程來培養(yǎng)五個不同谷氨酰胺合成酶piggyBac®中國倉鼠卵巢細胞CHO克隆。通過在線拉曼光譜法連續(xù)監(jiān)測殘余glucose葡萄糖、phenylalanine苯丙氨酸和methionine 甲硫氨酸的濃度變化，開發(fā)了partial least squares models偏最小二乘模型。通過持續(xù)監(jiān)測殘余代謝物濃度，自動調(diào)整三種補充成分的補料速率，從而保持葡萄糖、苯丙氨酸和甲硫氨酸在期望的設定點上，并確保其他營養(yǎng)物質(zhì)濃度在所有培養(yǎng)的克隆中保持在可接受的水平。

細胞系與培養(yǎng)

 

使用了Lonza HID平臺的 GS piggyBac® CHO clones細胞系，共有5個克隆體。采用了100*10⁵的初始接種密度，在1L或者5L的體積進行培養(yǎng)。

模型建立

 

使用了SIMCA v16分別對glucose, phenylalanine and methionine進行建模處理。首先是光譜區(qū)域的選擇，主要是基于了在純水中他們各自的特征光譜范圍。其次，通過 first derivative, Savitzky-Golay smoothing and standard normalvariate normalization (SNV) 的方法對原始光譜進行了預處理。建立的模型結(jié)果如Table 1所示。

參考已知的文獻并結(jié)合所建模型的R²以及root mean squared error of estimation and cross-validation (RMSEE/RMSECV) ，初步判斷模型可用。分對于glucose, phenylalanine, and methionine，如果RMSEPs 是 < 1 g/L, 100 mg/L and 100 mg/L，則判斷結(jié)果模型結(jié)果是可用的。

在線拉曼光譜的收集使用了來自于Endress +Hauser的RXN2 system系列，有著 785 nm的光源并內(nèi)置了Runtime 6.2的操作系統(tǒng)。探頭使用了220 mm和420mm（分別在1L和5L的培養(yǎng)體積）的BioOptic探頭。采用了5sx150 scan的曝光時間和曝光次數(shù)，總時長大約是12.5min。對于glucose, phenylalanine和methionine在線監(jiān)測數(shù)據(jù)，首先通過OPC的方式傳輸?shù)?strong style=";padding: 0px;outline: 0px;max-width: 100%;box-sizing: border-box !important;overflow-wrap: break-word !important">Delta-V(Emerson)，再在Delta-V對三個參數(shù)分別建立基于PID算法和on–off的控制回路，在監(jiān)測值低于目標值的時候，可以自動添加SF1, SF2和 SF3。SF1, SF2, and SF3對別對應了glucose, phenylalanine and methionine的補料。

離線的樣品是每日從HID的培養(yǎng)中取出送樣檢測。使用了來自于Nova Biomedical的Bioprofile FLEX2分化分析儀。對于氨基酸以及最后產(chǎn)物的分析分別使用了high-performanceliquid chromatography (HPLC)和Tridex Protein Analyzer (IdexHealth Sciences)

上訴三個圖分別為glucose, phenylalanine和methionine的自動控制情況以及SF1, SF2, and SF3在5個clones分別的添加總量。glucose的平均RMSEP是0.49 g/L (limit < 1 g/L), phenylalanine的平均RMSEP是40.72 mg/L (limit 100 mg/L) ,methionine的平均RMSEP是42.01 mg/L (limit 100 mg/L)，都是在可以接受的標準之內(nèi)的，

除此之外，文章還對其他的組分進行了監(jiān)測，以探究在HID平臺的自動回路控制培養(yǎng)模式對細胞生長代謝的影響。具體對比了培養(yǎng)體系中的histidine組氨酸、leucine亮氨酸、threonine蘇氨酸和ryptophan色氨酸的變化，以評估拉曼自動回路控制對殘留氨基酸濃度的影響。

可以看出，利用拉曼自動回路控制的方式，通過動態(tài)提供培養(yǎng)物所需的氨基酸，有助于降低克隆間代謝的差異性。

此外，為了進一步驗證拉曼自動控制的HID培養(yǎng)的效果，研究人員通過Peak VCC、Harvest VCC、 Harvest viability、Harvest lactate、Harvest NH₄、Harvest product concentration六個維度來評估對細胞生長和產(chǎn)量的實際影響。可以看出，在HID平臺上培養(yǎng)的所有克隆均獲得較高的Peak VCC(320.5±32.3×10⁵) cells/ mL)，且直到收獲當天，大多數(shù)HID培養(yǎng)保持在以上200.0×10⁵ cells/mL(4/5clones)?？偟膩碚f，除2 clone號外，在HID工藝上培養(yǎng)的所有克隆在收獲時都有很高的活力(2clone的收獲活力較低，是因為在培養(yǎng)結(jié)束時無意添加了堿基，導致VCC下降)。除2 clone，收獲時培養(yǎng)存活率均大于85%。

在HID培養(yǎng)過程中使用的自動培養(yǎng)策略的另一個好處是代謝副產(chǎn)物的低水平。乳酸和銨是代謝副產(chǎn)物，其積累與抑制細胞生長有關?？傮w而言，在HID工藝下培養(yǎng)的所有克隆的平均乳酸收獲濃度(0.8±0.5 g/L)和銨收獲濃度(0.07±0.02 g/L)均較低，這表明以該種控制策略培養(yǎng)，不僅對氨基酸副產(chǎn)物的積累影響很小，而且對其他常見抑制副產(chǎn)物的積累影響也很小。

最后，本研究使用的5個clone在HID培養(yǎng)過程中獲得了較高的收獲產(chǎn)物濃度(6.5±1.2 g/L)。相比之下，本研究中獲得的收獲產(chǎn)物濃度平均略高于之前所報道的(6.5±1.2 g/L)。也可以得出結(jié)論，在本研究中觀察到的較高的產(chǎn)品濃度，部分原因是由于提出的自動化策略可以維持高接種密度培養(yǎng)的營養(yǎng)需求，從而實現(xiàn)所需要補料操作的自動化，減少了危險副產(chǎn)品的積累。

該研究通過應用在線拉曼監(jiān)控技術和自動化反饋控制策略，實現(xiàn)了高接種密度下的增強型細胞培養(yǎng)過程的穩(wěn)定和高產(chǎn)量。這為生物制藥行業(yè)開發(fā)更高效、成本更低的生產(chǎn)過程提供了新的思路和方法。